2001年　9月　武　漢　科　技　學(xué)　院　學(xué)　報(bào)

JOURNALOFWUHANINSTITUTEOFSCIENCEANDTECHNOLOGY　Vo1.14No.3Sep.　2001黑曲霉植酸酶液體發(fā)酵工藝研究

王亞林　嚴(yán)建芳

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與化學(xué)工程系武漢430022)

摘　要　研究了黑曲霉液體培養(yǎng)生產(chǎn)植酸酶的發(fā)酵工藝,研究了培養(yǎng)基碳源、誘導(dǎo)物、表面活性劑等因素對(duì)產(chǎn)酶的影響,對(duì)發(fā)酵時(shí)間、pH變化規(guī)律等進(jìn)行了研究和分析。關(guān)鍵詞　植酸酶　黑曲霉　發(fā)酵　Ξ中圖分類號(hào)　Q815;Q814.9

植酸酶作為一種飼料和食品添加劑,在國(guó)內(nèi)外已開始得到廣泛應(yīng)用,特別是由于其在改善環(huán)境方面的作用,更是受到人們的極大關(guān)注。植酸酶主要存在于植物及微生物中,由于在微生物中含量較高而具有較大的開發(fā)價(jià)值。目前,美國(guó)、荷蘭和丹麥等國(guó)已先后運(yùn)用發(fā)酵法生產(chǎn)植酸酶,我國(guó)也已在進(jìn)行這方面的研究開發(fā)?？梢灶A(yù)計(jì),植酸酶制劑將有良好的市場(chǎng)前景。

1　材料與方法

1.1　菌種

黑曲霉(Aspergillusniger)WS201,武漢工業(yè)學(xué)院微生物室保存。1.2培養(yǎng)基

1.2.1種子培養(yǎng)基:豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基。

1.2.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(%):葡萄糖3.0,淀粉7.0,NH4NO30.5,蛋白胨0.2,CaCl20.2,MgSO4?7H2O0.05,KCl0.05,MnSO4.4;H2O0.03,pH值5.5。1.3培養(yǎng)方法

配制培養(yǎng)基時(shí)適當(dāng)加熱、搖動(dòng)或攪拌,使淀粉溶解成液態(tài)或膠狀,121℃滅菌20min。在30±1℃下?lián)u床培養(yǎng)3～5d(轉(zhuǎn)速220～250r/min)。1.4　植酸酶的測(cè)定

植酸酶活力的定義:37℃,pH5.5條件下每分鐘從植酸鈉中釋放出1μmol無(wú)機(jī)磷所需的酶為1u。

酶活測(cè)定方法:取0.1ml含酶液加至一潔凈試管中;加入0.9ml反應(yīng)液,反應(yīng)液為含0.5%植酸鈉的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.5),在37℃恒溫反應(yīng)30min;加入1ml10%三氯醋酸終止反應(yīng);加入2ml顯色液,搖勻后靜置15～30min顯色,顯色液由1%鉬酸銨50ml與3.66

Ξ收稿日期:2001-06-26

作者簡(jiǎn)介:王亞林,男,副教授,在讀博士生;研究方向:發(fā)酵工程、生化工程? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.

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gFeSO4?7H2O混合配制。將以上藍(lán)色溶液在721分光光度計(jì)上于750nm處比色,讀出吸光度A750nm,查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活(標(biāo)準(zhǔn)曲線為KH2PO4中磷含量與A750nm的關(guān)系曲線)。

2　結(jié)果與討論

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的研究2.1.1培養(yǎng)基碳源含量的影響

選擇葡萄糖和玉米淀粉為黑曲霉培養(yǎng)的碳源,葡萄糖和玉米淀粉用量之比為3∶7,培養(yǎng)基碳源的含量指葡萄糖和玉米淀粉用量之和。不同碳源用量發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表1(每個(gè)試驗(yàn)均做2～3個(gè)重復(fù),結(jié)果取平均值,下同)。

表1　培養(yǎng)基碳源的含量對(duì)產(chǎn)酶的影響

試驗(yàn)編號(hào)碳源含量(%)酶活(u/ml)

17.032.3

28.6.5

310.036.1

411.537.4

513.034.0

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳源用量超過10%時(shí),培養(yǎng)基粘度過大,造成培養(yǎng)基供氧不足,菌絲生長(zhǎng)不良,產(chǎn)酶下降且殘?zhí)沁^高。因而碳源用量以8.5%為宜。2.1.2植酸鈉的添加效果

植酸酶為一種誘導(dǎo)酶,理論上底物或底物類似物對(duì)植酸酶的產(chǎn)生應(yīng)該有一定的誘導(dǎo)作用。本試驗(yàn)選擇植酸鈉為誘導(dǎo)物,在培養(yǎng)基中少量添加,誘導(dǎo)植酸酶的產(chǎn)生,發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果見表2。

表2　植酸鈉添加對(duì)產(chǎn)植酸酶的影響

試驗(yàn)編號(hào)植酸鈉(%)酶活(u/ml)

1013.8

20.0524.1

30.1024.5

40.1531.0

50.2022.9

60.2525.8

表2結(jié)果表明:少量添加植酸鈉后產(chǎn)酶迅速增加,說明植酸鈉有明顯的誘導(dǎo)作用。植酸鈉

用量在(0.05～0.15)%范圍內(nèi)時(shí),產(chǎn)酶量可穩(wěn)定在一個(gè)相對(duì)較高的水平,植酸鈉用量過大則意義不大。

2.1.3表面活性劑的添加效果

黑曲霉產(chǎn)生的植酸酶是一種胞外酶,在培養(yǎng)基中添加少量的表面活性劑可提高細(xì)胞的通透性,有利于酶的產(chǎn)生。本試驗(yàn)選用吐溫-80(TW-80)為表面活性劑,設(shè)計(jì)了幾種不同的用量,發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果見表3。

表3　TW-80添加對(duì)產(chǎn)植酸酶的影響

試驗(yàn)編號(hào)

TW-80(%)

1035.9

20.0553.3

30.1058.1

40.1575.3

50.2055.5

酶活(u/ml)

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第3期　　　　　　　　　　　王亞林　等:　黑曲霉植酸酶液體發(fā)酵工藝研究　　　　　　　　　　33

從表3結(jié)果可見,TW-80添加量為0.05%時(shí),與不添加相比產(chǎn)酶增加明顯;TW-80添加量為0.15%時(shí),酶活達(dá)75.3(u/ml),產(chǎn)酶提高2倍以上;TW-80添加量繼續(xù)增加,則產(chǎn)酶開始下降,這是因?yàn)檫^量的表面活性劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害之故。2.2　發(fā)酵條件與過程研究2.2.1　培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)酶的關(guān)系黑曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)分為兩個(gè)階段,細(xì)胞生長(zhǎng)階段和產(chǎn)酶階段,發(fā)酵應(yīng)在產(chǎn)酶高峰期結(jié)束。本試驗(yàn)研究了發(fā)酵時(shí)間與產(chǎn)酶的關(guān)系,試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

從圖1可見,發(fā)酵前兩天產(chǎn)酶水平極低,之后迅速提高,其中在72～84h產(chǎn)酶維持在較高的水平,然后產(chǎn)酶開始緩慢下降。因此,發(fā)酵時(shí)間應(yīng)為72～84h。2.2.2　pH值與產(chǎn)酶的關(guān)系培養(yǎng)基初始pH值與發(fā)酵產(chǎn)酶的關(guān)系見圖2。結(jié)果表明pH值為5.5效果較好。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),接種后黑曲霉生長(zhǎng)導(dǎo)致pH下降,培養(yǎng)24h其pH值從5.5降至3.8左右,之后pH值緩慢回升。為觀察pH值與產(chǎn)酶的關(guān)系,在培養(yǎng)至24h人為調(diào)節(jié)pH為5.5繼續(xù)培養(yǎng),結(jié)果顯示這種調(diào)節(jié)對(duì)其產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用,但效果不是特別明顯,這方面的工作有待繼續(xù),結(jié)果見圖3、圖4。

圖1　培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)酶的關(guān)系　　　　圖2　培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖3　發(fā)酵液pH值隨時(shí)間的變化　　　　　圖4　發(fā)酵過程pH、酶活隨時(shí)間的變化

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3　結(jié)論

(1)培養(yǎng)基的研究表明:碳源用量以8.5%為宜;植酸鈉有明顯的誘導(dǎo)作用植酸鈉用量在0.05%～0.15%范圍內(nèi)為宜;與不添加相比,TW-80添加產(chǎn)酶增加明顯,添加量以0.15%為宜,酶活達(dá)75.3(u/ml),產(chǎn)酶提高2倍以上。

(2)發(fā)酵時(shí)間應(yīng)以72～84h為宜;黑曲霉生長(zhǎng)導(dǎo)致pH下降,在培養(yǎng)至24h人為調(diào)節(jié)pH為5.5繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)其產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用。

參　考　文　獻(xiàn)

[1]Yuong-okkin,Hyung-kwounkin.PurificationandPropertiesofathermostablephytasefromBacillussp.Ds11.En2zymeMicrob.Technil.1998,22(3):226.

[2]張若寒.植酸酶活性的檢測(cè)方法[J].中國(guó)飼料,1997,5:30232.

[3]石炳興.植酸酶的制備性質(zhì)及其在飼料工業(yè)的應(yīng)用[J].上海飼料,1996,3:728.

StudyonAspergillusNigerFermentationProcessesofPhytase

WANGYa2lin　YANJian2fang

Abstract　TheprocessesoffermentationforproducingPhytasewerestudied.Thesetestsincludedcom2positionsofculturemedium,suchas,C-resources,evocator,externalactivereagent.TherelationshipsoffermentingtimeandpHwerestudiedandanalysed.Keywords　phytase;aspergillusniger;fermentation

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