1、概述

為了符合2010年版GMP的要求，為了確保生產(chǎn)檢驗(yàn)出符合預(yù)定治療用途的產(chǎn)品，確保產(chǎn)品質(zhì)量控制合格，保證用藥的有效性，本報(bào)告針對地龍凍干粉效價(jià)測定方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。 2、驗(yàn)證目的

建立地龍凍干粉效價(jià)的測定方法，確認(rèn)該方法適合于該品種的效價(jià)檢查。 3、適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地龍凍干粉效價(jià)測定方法學(xué)的驗(yàn)證。 4、驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組成員及職責(zé) 部門及職務(wù) 驗(yàn)證工作中職務(wù) 職責(zé) 負(fù)責(zé)領(lǐng)導(dǎo)驗(yàn)證工作，負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案及報(bào)告的批準(zhǔn)。 負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)領(lǐng)導(dǎo)驗(yàn)證工作，負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案審核、驗(yàn)證報(bào)告的審核等各項(xiàng)工作。 驗(yàn)證方案、驗(yàn)證數(shù)據(jù)的審查、驗(yàn)證工作協(xié)調(diào)安排。 負(fù)責(zé)取樣及提供驗(yàn)證所需檢測數(shù)據(jù)。 負(fù)責(zé)收集各項(xiàng)驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)記錄，并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。 驗(yàn)證過程監(jiān)督檢查，確保結(jié)果可靠性。 負(fù)責(zé)儀器、設(shè)備、儀表、量具等的校正。 負(fù)責(zé)試藥、試劑、設(shè)備、對照品的購買。 公司副總經(jīng)理 驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組組長 質(zhì)監(jiān)部經(jīng)理 驗(yàn)證小組組長 QC主管 QC QC QA 設(shè)備員 采購員 5、驗(yàn)證進(jìn)度計(jì)劃

組員 組員 組員 組員 組員 組員 驗(yàn)證小組提出完整的驗(yàn)證計(jì)劃，經(jīng)批準(zhǔn)后實(shí)施。 從 年 月 日至 年 月 日 6、相關(guān)文件

國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（蚓激酶）；國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)WS3-361（Z-047）-2003（Z）；2010年版藥典一部附錄ⅩⅧA中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則；實(shí)驗(yàn)室控制系統(tǒng)GMP實(shí)施指南第11章分析方法的驗(yàn)證和確認(rèn)；藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南第三篇第一章檢驗(yàn)方法驗(yàn)證；藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010

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年修訂）第四章第四節(jié)分析方法驗(yàn)證。 7、驗(yàn)證內(nèi)容

7.1為了確保驗(yàn)證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠，采取以下幾個(gè)先行保障措施 儀器：已經(jīng)過校正并在有效期內(nèi)

人員：均經(jīng)過培訓(xùn)，熟悉方法及使用的儀器 對照品：均購自中國食品藥品鑒定研究院

材料：所用材料，包括試劑、實(shí)驗(yàn)用容器等，均符合檢驗(yàn)要求，不給實(shí)驗(yàn)帶來污染、誤差。

檢查人： 日期： 確認(rèn)人： 日期： 7.2驗(yàn)證方法 7.2.1效價(jià)測定方法 7.2.1.1試劑配制

①磷酸鹽緩沖液（PH7.8）

取磷酸氫二鈉21.4g,氯化鈉5.26g,加水900ml，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH值至7.8，再加水至1000ml。

②（牛）纖維蛋白原溶液

取70u纖維蛋白原，加磷酸鹽緩沖液（PH7.8）20ml，水浴微熱使溶解。用時(shí)取20ml。

③（牛）纖維蛋白溶酶原

取12u纖維蛋白溶酶原，加磷酸鹽緩沖液（PH7.8）12ml使溶解，制成每1ml含1酪蛋白單位的溶液，用時(shí)取3ml。

④(牛)凝血酶溶液

取70u凝血酶，加磷酸鹽緩沖液（PH7.8）7ml使溶解，用時(shí)取3ml。 ⑤瓊脂糖溶液

取瓊脂糖330mg，加磷酸鹽緩沖液（PH7.8）25ml，加熱使溶后體積為20ml，置55℃水浴中恒溫待用。 7.2.1.2纖維蛋白板的制作

將②、⑤、③、④按順序依次加入混勻，迅速倒入水平放置的平皿（8.5cm×23.5cm）中，若有氣泡，可在未凝固之前，用小鋼鏟將氣泡趕走，待其凝固后，蓋上蓋，放4℃冰箱保存1小時(shí)后，取出，此板即為標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白板。

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7.2.1.3檢測

取地龍凍干粉約10mg，加水制成每1ml含1mg的溶液作為供試品溶液。取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品，制成濃度分別為每1ml中含10000和8000蚓激酶單位的溶液。用直徑約為3mm的不銹鋼小管，在纖維蛋白板上打若干個(gè)小孔，精密量取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液10μl，分別點(diǎn)在小孔中，將板水平放入37℃恒溫箱中保溫18個(gè)小時(shí)后，取出，測得各溶圈直徑并計(jì)算出溶圈面積。以蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品單位數(shù)與溶圈面積的比值為計(jì)算系數(shù)，乘以供試品的溶圈面積，計(jì)算供試品效價(jià)單位數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品應(yīng)各作兩點(diǎn)，以平均值計(jì)算。 7.2.2耐用性試驗(yàn)

7.2.2.1不同瓊脂糖對試驗(yàn)結(jié)果的影響

按照效價(jià)測定方法測定 ， 批地龍凍干粉的效價(jià)，分別用2個(gè)批號的瓊脂糖鋪板。 a、

干擾較小

b、驗(yàn)證實(shí)施記錄和結(jié)論

表1 不同瓊脂糖的檢測結(jié)果

瓊脂糖批號 結(jié)論：

檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期： 7.2.2.2不同纖維蛋白溶酶原對試驗(yàn)結(jié)果的影響

按照效價(jià)測定方法測定 ， 批地龍凍干粉的效價(jià)，分別用2個(gè)批號的纖維蛋白原。 a、可接受標(biāo)準(zhǔn) 干擾較小

b、驗(yàn)證實(shí)施記錄和結(jié)論

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可接受標(biāo)準(zhǔn)

樣品 效價(jià)（u） 樣品 效價(jià)（u） 表2 不同纖維蛋白原的檢測結(jié)果 纖維蛋白溶酶原批號 結(jié)論：

檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期： 7.2.3準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取蚓激酶對照品加水, 制成每1ml含蚓激酶分別為10000, 8000, 5000u的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液8μl點(diǎn)樣，每個(gè)濃度各分別點(diǎn)樣3次。按效價(jià)測定方法檢測并計(jì)算回收率。 7.2.3.1可接受標(biāo)準(zhǔn)

回收率為95.0-105.0%，回收率RSD≤5.0% 7.2.3.2驗(yàn)證實(shí)施記錄及結(jié)論

表3 蚓激酶加樣回收率

對照品濃度（u/ml） 點(diǎn)樣次數(shù) 1 10000 2 3 1 8000 2 3 1 5000 2 3 結(jié)論：

檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期：

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樣品 效價(jià)（u） 樣品 效價(jià)（u） 理論效價(jià)（u） 測得效價(jià)（u） 回收率（%） RSD（%） 7.2.4重復(fù)性和中間精密度試驗(yàn)

取供試品溶液（批號 ），由兩位檢測人員按照效價(jià)測定方法，測定樣品中蚓激酶的效價(jià)。每人檢測6次記錄檢測結(jié)果。將各6組數(shù)據(jù)進(jìn)行對比求出平均值，再求出重復(fù)性RSD值，將兩人的檢測結(jié)果進(jìn)行對比求出12組數(shù)據(jù)的平均值，再求出中間精密度RSD值。 7.2.4.1可接受標(biāo)準(zhǔn)

重復(fù)性RSD≤5.0%，中間精密度RSD≤5.0%。 7.2.4.2驗(yàn)證實(shí)施記錄及結(jié)論

表4 效價(jià)檢測結(jié)果

次數(shù) 1 2 3 4 5 6 平均值（u） 重復(fù)性RSD值（%） 總平均值（u） 中間精密度RSD值（%） 結(jié)論：

檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期： 7.2.5專屬性試驗(yàn)

陰性對照溶液：水溶液10μl

對照品溶液：10000u/ml的蚓激酶溶液10μl

空白回收溶液：水溶液10μl+10000u/ml的蚓激酶溶液10μl 7.2.5.1可接受標(biāo)準(zhǔn) 陰性對照無干擾。 7.2.5.2結(jié)論

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檢測結(jié)果1（u） 檢測結(jié)果2（u）

檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期： 7.2.6線性范圍

取蚓激酶對照品加水, 制成每1ml含蚓激酶分別為10000, 8000, 5000u的對照品溶液。分別精密吸取上述10000u/ml對照品溶液9μl, 8μl,和上述8000u/ml對照品溶液9μl,8μl,以及上述5000u/ml對照品溶液10μl，8μl，6μl點(diǎn)樣，測定溶圈直徑，并計(jì)算出溶圈面積。以點(diǎn)樣量( u )為橫坐標(biāo), 溶圈面積（mm2）為縱坐標(biāo)求得回歸方程。 7.2.6.1 可接受標(biāo)準(zhǔn)

相關(guān)系數(shù)r≥0.980 7.2.6.2 驗(yàn)證實(shí)施記錄及結(jié)論

表5 線性范圍檢驗(yàn)結(jié)果

點(diǎn)樣量(u) 溶圈面積(mm2) 圖1 點(diǎn)樣量與溶圈面積關(guān)系的線性關(guān)系圖

結(jié)論：

檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期：

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1 2 3 4 5 6 7 8、偏差分析

在驗(yàn)證過程中，應(yīng)嚴(yán)格按照驗(yàn)證方案進(jìn)行操作和判定。 8.1指標(biāo)全部符合標(biāo)準(zhǔn)，無偏差。

8.2當(dāng)出現(xiàn)偏差時(shí)，應(yīng)按偏差處理操作規(guī)程（SOP-ZL-00-009）進(jìn)行處理：針對偏差應(yīng)展開調(diào)查分析，對于確認(rèn)是因操作不當(dāng)?shù)茸陨碓蛟斐桑瑧?yīng)重新進(jìn)行測試。 序號 1 2 3 偏差 處理辦法 確認(rèn)結(jié)果是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn) 是 否 檢查人： 日 期： 9、驗(yàn)證結(jié)論

結(jié)論人： 日期： 10、再驗(yàn)證

10.1 當(dāng)分析方法發(fā)生較大變更需要再驗(yàn)證； 10.2 在日常監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)分析方法異常需進(jìn)行再驗(yàn)證；

10.3 再驗(yàn)證時(shí)應(yīng)按照前期驗(yàn)證采用的方法對地龍凍干粉效價(jià)測定方法學(xué)進(jìn)行再驗(yàn)證，或根據(jù)實(shí)際情況修訂補(bǔ)充驗(yàn)證方案后進(jìn)行再驗(yàn)證。

確認(rèn)人： 日 期： 7 / 7