doi:10.15933/j.cnki.1004-3268.2020.04.012

煙草病原菌及其生防菌株對烯酰嗎啉的敏感性

郭　敬1,湯玲玲1,趙世民2,李淑君3,康業(yè)斌1

(1.河南科技大學林學院,河南洛陽471023;2.河南省洛陽市煙草公司,河南洛陽471023;

3.河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所,河南許昌461000)

摘要:為明確煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)等主要土傳病原真菌與哈茨木霉(Trichodermahar-zianum)等供試生防菌株對烯酰嗎啉的敏感性,采用菌絲生長速率法測定了烯酰嗎啉對煙草疫霉、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、茄病鐮刀菌(Fusariumsola-ni)、哈茨木霉菌絲生長的抑制作用,采用孢子抑制法測定了烯酰嗎啉對煙草疫霉孢子囊形成、哈茨木霉分生孢子分化的抑制作用,采用稀釋涂布平板法分別測定了烯酰嗎啉對枯草芽孢桿菌(Bacil-lussubtilis)、金黃垂直鏈霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)的抑制作用。結(jié)果表明,烯酰嗎啉對煙

草疫霉菌絲生長及孢子囊形成有顯著抑制作用,對煙草疫霉菌絲生長的EC50為0.4676μg/mL;對

哈茨木霉菌絲生長及分生孢子分化抑制作用較低;對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌和枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌無明顯抑制作用。因此,烯酰嗎啉可以與供試生防菌株混合施用防治煙草黑脛病。

關(guān)鍵詞:烯酰嗎啉;煙草;病原菌;生防菌株;敏感性;煙草黑脛病

中圖分類號:S435.72　　文獻標志碼:A　　文章編號:1004-3268(2020)04-0087-06

SensitivityofTobaccoPathogensandTheirBiocontrol

StrainstoDimethomorph

(1.CollegeofForestry,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471023,China;2.LuoyangBranch

GUOJing1,TANGLingling1,ZHAOShimin2,LIShujun3,KANGYebin1

ofHenanProvincialTobaccoCompany,Luoyang471023,China;3.TaboccoResearchInstitute,

HenanAcademyofAgriculturalSciences,Xuchang461000,China)

Abstract:Toidentifythesensitivityofthemainsoil-bornepathogensoftobaccosuchasPhytophthora

nicotianaeandtheircandidatebiocontrolstrainssuchasTrichodermaharzianumtodimenthomorph,myce-liumgrowthratemethod,sporeinhibitionmethod,dilution-platemethodwereusedtodeterminetheinhibi-toryeffectofdimethomorphonmyceliumgrowthofP.nicotianae,Pythiumaphanidermatum,RhizoctoniaT.harzianum,andonBacillussubtilis,Streptomycesaureoverticillatus.Theresultsshowedthatdimethomor-solani,Fusariumsolani,T.harzianum,sporangiaproductionofP.nicotianaeandconidiadifferentiationofphhadasignificantinhibitoryeffectonmyceliumandsporangiaofP.nicotianae,andtheEC50valueofitsmyceliumgrowthwas0.4676μg/mL;andithadnostrongeffectonP.aphanidermatum,R.solani,F.so-lani,T.harzianum,B.subtilis,S.aureoverticillatus.Therefore,dimethomorphcanbemixedwiththecandi-datebiocontrolstrainstocontroltobaccoblackshank.

Keywords:Dimenthomorph;Tobacco;Pathogen;Biocontrolstrain;Sensitivity;Tobaccoblackshank

收稿日期:2020-01-10

基金項目:河南省煙草公司科學研究與技術(shù)開發(fā)重點項目(HYKJ201610,LYKJ201804)

作者簡介:郭　敬(1996-),女,河南新鄉(xiāng)人,在讀碩士研究生,研究方向:植物免疫學。E-mail:gjing2019@163.com通信作者:康業(yè)斌(19-),男,河南南陽人,教授,博士,主要從事植物免疫學研究。E-mail:kangyb999@163.com

88

河南農(nóng)業(yè)科學

第49卷

　　煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)、瓜果腐霉

(Pythiumaphanidermatum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)分別引起煙草

黑脛病、猝倒病、立枯病、根腐病,都屬于土傳病原真菌

[1-3]

現(xiàn),烯酰嗎啉對云南省德宏州煙草黑脛病有較好的。賀曉輝等

[4]

采用菌絲生長速率法研究發(fā)

防控效果。劉暢等[5]在山東煙田土壤中篩選到對山東煙草黑脛病有較強拮抗作用的生防菌株,根據(jù)菌株形態(tài)和培養(yǎng)特征、ITS序列分析,鑒定該菌株為哈茨木霉(Trichodermaharzianum);RAO等[6]通過

雙重培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn),哈茨木霉可以抑制瓜果腐霉的生長;SANTAMARINA等

[7]

研究表明,哈茨木霉對立

枯絲核菌具有較好的拮抗作用。HAN等[8]的研究結(jié)果顯示,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對煙草疫霉具有很強的拮抗作用,可以破壞其菌絲結(jié)構(gòu),引起菌絲畸形、破裂和原生質(zhì)滲漏;劉丹等[9]綜合分析認為,枯草芽孢桿菌可以通過根際定殖競爭、生物膜競爭、抗菌作用、細胞溶解酶作用誘導系統(tǒng)抗病性,抑制煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum);蔡璘

等[10]研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌對二孢白粉菌(Erys-iphecichoracearum具有良好的抑制作用DC.。)陳倩倩等菌絲生長[11]和研究表明分生孢子,萌金黃發(fā)

垂直鏈霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)對瓜果腐

霉、煙草疫霉、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)具有拮抗作用。尹敬芳等[12]研究表明,烯酰嗎啉-枯草芽孢桿菌菌藥合劑可以協(xié)同防治辣椒疫病(P.capsici)。但在防治煙草病害方面,烯酰嗎啉對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌的抑制作用,以及對生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌的抑制作用均鮮有報道。鑒于此,測定了煙草病原菌煙草疫霉、瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌,以及生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌對烯酰嗎啉的敏感性,旨在明確煙草病原菌及其生防菌株對烯酰嗎啉的抗藥性水平,為烯酰嗎啉和哈茨木霉、枯草芽孢桿菌或金黃垂直鏈霉菌混合施用防治煙草主要土傳病原真菌提供參考。

1　1.1　材料和方法

材料

煙草病原菌煙草疫霉、瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌和生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌,均由河南科技大學植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室提供。98%烯酰嗎啉購自上海江萊生物科技有限公司。

1.2　方法

1.測定2.1　　在烯酰嗎啉對供試真菌菌絲生長的抑制作用燕麥(OA)培養(yǎng)基上培養(yǎng)煙草疫霉,在菌落邊緣打取直徑6含烯酰嗎啉0.2、0.4、0.mm的菌餅6、0.8、1.,菌絲面朝0下接種到

板,以不含烯酰嗎啉的OA平板作為對照μg/mL的OA;在馬平

鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌、哈茨木霉,在菌落邊緣打取直徑6茄病鐮刀菌接種到含烯酰嗎mm的菌餅,將瓜啉果0.腐5、1.霉、立0、2.枯絲0、4.核菌0、、

8.0酰嗎啉μg/0.mL5、1.的PDA0、2.0、4.平板0以不含烯酰嗎啉的PDA平μg,哈茨木霉接種到含烯

板/mL作為的對PDA照。平板每組處理,設置3個重復。25℃恒溫培養(yǎng)2~5理菌絲的生長情況,十字交叉法測量菌落直徑d后檢查各處

,計算抑制率。比較烯酰嗎啉對各病原菌和生防菌的抑制作用,并運用DPS軟件建立烯酰嗎啉對煙草疫霉的毒力回歸方程,計算抑制其菌絲生長的EC生長抑制率=(對照菌落直徑-處理50值。菌落直

徑)/對照菌落直徑×100%。

1.茨木霉分生孢子分化的抑制作用測定2.2　烯酰嗎啉對供試煙草疫霉孢子囊形成和哈　將煙草疫霉接種在含烯酰嗎啉0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μg為對照/mL,的培養(yǎng)OA5平板~7上為0.1%的KNOd后,以,在不培含養(yǎng)烯皿酰內(nèi)嗎啉的OA平板加入質(zhì)量分數(shù)

誘導孢子囊產(chǎn)生3溶液濕潤菌絲,25,以加入無菌水為對照℃恒溫培養(yǎng)。在菌落中3d央打取6個直徑為6鏡下隨機選取1個視野觀察菌餅上的孢子囊個數(shù)mm的菌餅,在10倍光學顯微

,計算抑制率,每個質(zhì)量濃度設置3個重復。

將烯酰嗎啉加入冷卻至50液體(PD)培養(yǎng)基中,配制成0.5、1.℃的馬鈴薯葡萄糖

0、2.0、4.0mL啉為對照的含藥培養(yǎng)基,加入4(100塊哈茨木霉菌餅mL/250mL),28,μg/

以不加烯酰嗎培養(yǎng)10d后,用2層紗布過濾取上清液℃,、170通過r血/min計數(shù)板觀察分生孢子的個數(shù),計算抑制率。

球

孢子(囊)抑制率=[對照孢子(囊)個數(shù)-處理孢子(囊)個數(shù)]/對照孢子(囊)個數(shù)×100%。1.作用測定2.3　烯酰嗎啉對供試拮抗細菌與放線菌的抑制　選擇牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,選擇高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃垂直鏈霉菌。將烯酰嗎啉分別與冷卻至50一號培養(yǎng)基混勻,配制成0.5、1.0、1.℃5、2.的NA、0、2.高氏

5、3.0對照μg。/每個培養(yǎng)皿加入mL的含毒平板,100以不μL含烯適宜質(zhì)量濃度的菌

酰嗎啉的平板為

　第4期郭　敬等:煙草病原菌及其生防菌株對烯酰嗎啉的敏感性

懸液進行涂布,每個質(zhì)量濃度3個重復,28℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、4d后,統(tǒng)計各個培養(yǎng)皿內(nèi)的菌落個數(shù),計算抑制率。照菌落數(shù)×100%。

菌落抑制率=(對照菌落數(shù)-處理菌落數(shù))/對

生長速率法測定煙草疫霉對烯酰嗎啉的敏感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),烯酰嗎啉對煙草疫霉菌絲生長具有很好的抑制作用,隨著烯酰嗎啉質(zhì)量濃度的增加,煙草疫霉的菌落直徑逐漸減小(圖1),當烯酰嗎啉的質(zhì)量濃度為1.0μg/mL時,對煙草疫霉菌絲生長的抑制率

2　結(jié)果與分析

達到86.76%(表1)。經(jīng)DPS軟件進行數(shù)據(jù)分析,煙草疫霉菌絲生長對烯酰嗎啉敏感性的毒力回歸方

2.1　煙草病原菌對烯酰嗎啉的敏感性

2.1.1　煙草疫霉對烯酰嗎啉的敏感性　采用菌絲

程為y=3.0913x+6.0204,EC50為0.4676μg/mL,相關(guān)系數(shù)r為0.9948。

a.CK;b.0.2μg/mL;c.0.4μg/mL;d.0.6μg/mL;e.0.8μg/mL;f.1.0μg/mL

圖1　烯酰嗎啉對煙草疫霉菌絲生長的抑制作用

Fig.1　InhibitionofdimethomorphonmyceliumgrowthofP.nicotianae

表1　烯酰嗎啉對煙草疫霉菌絲生長的抑制作用

Tab.1　InhibitionofdimethomorphonmyceliumgrowthofP.nicotianae

項目Item

抑制率/%Inhibitionrate

00

0.214.48

0.4

烯酰嗎啉質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentrationofdimethomorph

0.60.876.20

1.086.76

37.58

60.77

y=3.0913x+6.0204

毒力回歸方程

ToxicregressionequationEC50/(μg/mL)

相關(guān)系數(shù)

Correlationcoefficient

0.4676

0.9948

　　通過孢子抑制法發(fā)現(xiàn),煙草疫霉孢子囊的形成煙草疫霉孢子囊數(shù)目逐漸減少(圖2),當烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為0.7μg/mL時,對煙草疫霉孢子囊形成

性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這3種土傳病原真菌菌絲生長對烯酰嗎啉不敏感。隨著烯酰嗎啉質(zhì)量濃度的增加,瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌落直徑?jīng)]有明顯變化(表3)。當烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為0.5μg/mL時,

對烯酰嗎啉敏感。隨著烯酰嗎啉質(zhì)量濃度的增加,

的抑制率為80.0%(表2),表明烯酰嗎啉可以有效抑制煙草疫霉孢子囊的形成。

2.1.2　瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌絲生長對烯酰嗎啉的敏感性　用菌絲生長速率法測定瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌對烯酰嗎啉的敏感

對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌絲生長的抑制率分別為-2.00%、7.12%、0;烯酰嗎啉質(zhì)量濃度11.02%、4.78%。表明施用烯酰嗎啉防治煙草疫霉時,對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌絲生長

為8.0μg/mL時,對其菌絲生長的抑制率分別為0、

90

河南農(nóng)業(yè)科學第49卷

無明顯抑制作用。

a.CK;b.0.1μg/mL;c.0.2μg/mL;d.0.3μg/mL;e.0.4μg/mL;f.0.5μg/mL;g.0.6μg/mL;h.0.7μg/mL

圖2　烯酰嗎啉對煙草疫霉孢子囊形成的抑制作用

Fig.2　InhibitionofdimethomorphonsporangiaproductionofP.nicotianae

表2　烯酰嗎啉對煙草疫霉孢子囊形成的抑制作用

Tab.2　InhibitionofdimethomorphonsporangiaformationofP.nicotianae

00.10.20.30.40.50.60.7

烯酰嗎啉質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentrationofdimethomorph

隨機視野的孢子囊數(shù)/個

Numberofsporangiainrandomview

109.676.335.674.333.442.442.00

抑制率/%Inhibitionrate

03.336.743.356.765.675.680.0

表3　烯酰嗎啉對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌菌絲生長的抑制作用

Tab.3　InhibitionofdimethomorphonmyceliumgrowthofP.aphanidermatum,R.solani,F.solani

0

烯酰嗎啉質(zhì)量濃度/(μg/mL)

Concentrationofdimethomorph

瓜果腐霉P.aphanidermatum

菌落直徑/cmColonydiameter

立枯絲核菌R.solani

茄病鐮刀菌F.solani

0.51.02.04.08.0

5.005.104.865.055.235.00

抑制率/%Inhibitionrate

-2.00-1.00-4.6002.800

菌落直徑/cmColonydiameter

5.905.485.655.805.675.25

抑制率/%Inhibitionrate

7.124.241.6911.023.900

菌落直徑/cmColonydiameter

6.276.276.056.125.935.97

抑制率/%Inhibitionrate

00

3.512.395.424.78

2.2　生防菌株對烯酰嗎啉的敏感性

可以與生防菌株哈茨木霉聯(lián)合使用。

2.2.2　枯草芽孢桿菌與金黃垂直鏈霉菌對烯酰嗎啉的敏感性　通過稀釋涂布平板法測定發(fā)現(xiàn),生防菌株枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌對烯酰嗎啉不敏感。烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為0.5μg/mL時,對枯草

2.2.1　哈茨木霉菌絲生長及分生孢子分化對烯酰嗎啉的敏感性　通過菌絲生長速率法和孢子抑制法測定生防菌株哈茨木霉對烯酰嗎啉的敏感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其菌絲生長及分生孢子分化對烯酰嗎啉不敏感。當烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為0.5μg/mL時,對哈茨木霉菌

芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌無明顯抑制作用;烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為3.0μg/mL時,對其抑制率為

絲生長及分生孢子分化的抑制率分別為-1.67%、菌絲生長及分生孢子分化的抑制率分別為11.98%和28.94%(表4)。表明施用烯酰嗎啉防治煙草疫霉時,-19.00%;烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為4.0μg/mL時,對其

煙草疫霉時,可以與生防菌株枯草芽孢桿菌或金黃垂直鏈霉菌聯(lián)合應用。

-10.37%、17.85%(表5)。表明施用烯酰嗎啉防治

　第4期郭　敬等:煙草病原菌及其生防菌株對烯酰嗎啉的敏感性

表4　烯酰嗎啉對哈茨木霉菌絲生長及分生孢子分化的抑制作用

Tab.4　InhibitionofdimethomorphonmyceliumgrowthandconidiadifferentiationofT.harzianum

91

00.51.02.04.0

烯酰嗎啉質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentrationofdimethomorph

菌落直徑/cmColonydiameter

7.187.306.757.426.32

抑制率/%Inhibitionrate

0-1.675.99-3.3411.98

5個中格孢子的總數(shù)/個

Numberofsporangiain5middlelattices

103.67123.37122.3396.6773.67

抑制率/%Inhibitionrate

0-19.00-18.006.7528.94

表5　烯酰嗎啉對枯草芽孢桿菌和金黃垂直鏈霉菌的抑制作用Tab.5　InhibitionofdimethomorphonB.subtilisandS.aureoverticillatus

烯酰嗎啉質(zhì)量濃度/(μg/mL)Concentrationofdimethomorph

枯草芽孢桿菌B.subtilis

單菌落個數(shù)

Numberofsinglecolony

金黃垂直鏈霉菌S.aureoverticillatus

抑制率/%Inhibitionrate

00.51.01.52.02.53.080.3385.3385.0084.0079.3384.0088.660-6.22-5.81-4.571.24-4.57-10.37

單菌落個數(shù)

Numberofsinglecolony

141.60134.20130.75128.60126.00119.00116.33

抑制率/%Inhibitionrate

05.237.669.1811.0215.9617.85

3　結(jié)論與討論

垂直鏈霉菌幾乎沒有抑制作用,但烯酰嗎啉與供試生防菌聯(lián)合后的田間防治效果需要進一步探究。

烯酰嗎啉對煙草疫霉菌絲生長及孢子囊形成有0.4676μg/mL;烯酰嗎啉質(zhì)量濃度為4.0μg/mL

烯酰嗎啉為嗎啉類殺菌劑,可用于防治由鞭毛

菌亞門卵菌綱真菌引起的蔬菜霜霉病、疫病等病害[13],可以干擾病原菌細胞壁聚合體的組裝,抑制菌絲生長,以及孢子囊、游動孢子、休眠孢子的萌發(fā)和游動孢子囊的形成[14]。本試驗結(jié)果表明,烯酰嗎對菌絲生長的EC50為0.4676μg/mL,與戰(zhàn)徊旭

顯著抑制作用,對煙草疫霉菌絲生長的EC50為時,對哈茨木霉菌絲生長及分生孢子分化的抑制率

啉顯著抑制了煙草疫霉菌絲生長和孢子囊的產(chǎn)生,等[15]的研究結(jié)果一致。

5.42%;烯酰嗎啉質(zhì)量濃度3.0μg/mL時,對枯草芽孢桿菌、金黃垂直鏈霉菌的抑制率為-10.37%、

分別為11.98%和28.94%,對瓜果腐霉、立枯絲核菌、茄病鐮刀菌的抑制率分別為-4.60%、3.90%、

草疫霉抗藥性發(fā)生[16]。胡燕[17]測定了烯酰嗎啉對煙草疫霉繼代培養(yǎng)物的毒力,結(jié)果表明,煙草疫霉對烯酰嗎啉存在較大的抗藥性風險。牟文君等

[18]

單一使用烯酰嗎啉防治煙草黑脛病,易導致煙

17.85%。烯酰嗎啉可以和供試生防菌株聯(lián)合施用防治煙草黑脛病。

參考文獻:

通

過煙草疫霉敏感菌株與抗性菌株纖維素合酶基因序列的比對,檢測到纖維素合酶基因CesA3上存在V1109L突變和Q1077H突變,說明煙草疫霉同時存在2種突變位點。

進植物生長的作用[19];但受環(huán)境條件、使用方法等的影響,防效不穩(wěn)定

[20]

生防菌不僅可以抑制病原菌的生長,而且有促

。為了解決生防制劑見效

慢、防效不穩(wěn)和化學殺菌劑存在的抗藥性及農(nóng)藥殘留等問題,可以將生防菌劑和化學殺菌劑混合使用,起到優(yōu)勢互補、降低農(nóng)藥使用量、增強防效和擴大病害防治范圍的作用

[21]

酰嗎啉與氟吡菌胺、解淀粉芽孢桿菌混合使用防治煙草黑脛病,較單獨使用生防菌劑和殺菌劑防效分別提高了22.93%、29.49%。本試驗結(jié)果表明,烯酰嗎啉對供試生防菌株哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、金黃

。牟文君等

[22]

研究表明,烯

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